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施一公研究组发文报道酵母B*剪接体电镜结构 捕获最后一个剪接体基本状态

 

时间:2019-03-20
来源:清华新闻网  【责任编辑:】
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  清华新闻网3月15日电 3月15日,清华大学生命学院施一公教授研究组就剪接体的机理与结构研究,于《细胞》(Cell)期刊发表题为《催化激活状态的酵母剪接体结构揭示RNA剪接分支反应的机理》(Structures of the Catalytically Activated Yeast Spliceosome Reveal the Mechanism of Branching)的科研论文,揭示了剪接体第一步剪接反应前的瞬变状态——催化激活剪接体(catalytically activated spliceosome,定义为“B*复合物?#20445;?个不同构象?#27597;?#20998;辨率三维结构,这是目前RNA剪接循环中最后一个未被解析的基本状态。至此,施一公研究组成为世界上首个、也是唯一一个成功捕获并解析了RNA剪接过程中所有完全组装剪接体高分辨率三维结构系列成果的团队。该文报道的这4个同一状态却不同构象的剪接体结构,整体分辨率为2.9埃-3.8埃,核心区域的分辨率高达2.7埃,是目前报道的最高分辨率剪接体结构,该结构?#29366;?#25581;示了第一步剪接反应发生过程中的动态变化,展现了剪接因子对于剪接反应发生的重要作用,第一次从结构信息中回答了剪接体对不同pre-mRNA底物识别的特异性等重要科学问题。

  1977年,科学家们?#29366;?#21457;现来自于腺病?#38236;膍RNA与其对应的DNA转录模板并不能形成连续的杂交双链,而是在杂交双链的不同位置伸出了环状的DNA单链。这个重大发现表明,遗传信息从DNA传递到mRNA上并不只是通过转录,还需要pre-mRNA剪接来进一?#37237;?#25104;“无效”遗传信息的去除与?#34892;?#36951;传信息的拼接。“无效”的遗传信息不具有翻译功能,被称为内含子,而可以被核糖体翻译的?#34892;?#36951;传信息叫做外显子,内含子被去除、外显子被连接这一过程?#27425;猂NA剪接。RNA剪接普遍存在于真核生物中,随着物种的进化,含有内含子的基因数量增加,发生RNA剪接的频?#23460;?#30456;应增高,使得一个基因编码多个蛋?#23383;?#25104;为可能,极大的丰富了蛋?#23383;?#32452;的多样性,也是真核生物多样性的重要原因之一。

  RNA剪接是真核生物基因表达调控的重要环节之一,其化学本质是两步转酯反应。这种?#27492;?#31616;单的化学反应在细胞中难以自行发生,而负责执行这一化学反应的是细胞?#22235;?#19968;个巨大且高度动态变化的分子机器——剪接体(spliceosome)。从1977年?#29366;?#21457;现RNA剪接至本世?#32479;酰?#31185;学家们通过免疫沉淀、基因敲除、交联质谱、建立体外剪接反应系统等研究手段,初步建立起剪接体的组装、激活与解聚的发生过程,以及蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间的相互作用、相互调控等复杂的RNA剪接调控网络。在剪接反应过程中,多种蛋白-核酸复合物及剪接因子按照高度精确的顺序发生结合、重排和解聚,依次形成预组装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP(U4/U6.U5三小核核糖核蛋白复合物)以及至少8个状态的完全组装剪接体pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS复合物(图1)。

   

  图1 RNA剪接示意图

  (?#35745;?#26469;源: Yan, C., Wan, R., & Shi, Y. (2019).Cold Spring Harbor perspectives in biology, 11(1), a032409.)

  由于剪接体高度的动态?#38498;?#22797;?#26377;裕?#33719;得不同状态的剪接体?#27597;?#20998;辨率三维结构被公认为世界难题。在这种巨大的挑战下,施一公教授率领研究组迎难而上,经过7年的努力,终于在2015年?#29366;?#25253;道了裂殖酵母剪接体3.6埃?#27597;?#20998;辨率结构,?#29366;?#23637;示了剪接体催化中心近原子分辨率的结构。这一重大研究成果对RNA剪接机理的研究产生革命性影响。自2015年第一个剪接体结构发表以后,施一公研究组相继解析?#22235;?#37202;酵母剪接体复合物处于8个不同状态?#27597;?#20998;辨率结构,分别是3.8埃的预组装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.3埃-4.6埃的预催化剪接体前体pre-B complex、3.9埃的预催化剪接体B complex、3.5埃的激活状态剪接体Bact complex、3.4埃的第一步催化反应后剪接体C complex、4.0埃的第二步催化激活剪接体C* complex、3.6埃的完成两步转酯反应后的剪接体P complex,以及3.5埃的内含子套索剪接体ILS complex的结构。这些已解析的剪接体基本覆盖了整个RNA剪接循环,从分子层面揭示了剪接体催化RNA剪接两步反应的工作机理,同时为理解剪接体的组装、激活和解聚等过程的发生提供结构依据。然而,最后一个未被解析的完全组装剪接体B* complex,对于理解第一步剪接反应的发生具有至关重要的作用。由于其高度的动态性与瞬时性,如何捕获B* complex成为领域内的一大难题,也是世界上不同课题组争先解决的问题之一,捕获并解析其结构迫在眉睫。

  尽管之前积累了大量剪接体结构研究的经验,施一公研究组在针对如何捕获稳定的B* complex时,?#35789;?#20030;步维艰,困难重重。由于B* complex和C complex是第一步剪接反应发生时一前一后的两个状态,领域内对其鉴定的核心区别在于5’剪接位点与分支点之间的磷酸二脂键是否形成。因此,在不影响剪接体正常组装?#22270;?#27963;的前提下,如何阻止第一步反应发生,并且保持5’剪接位点与分支点已经进入RNA剪接的活性反应中心,并形成反应前的活性位点,成为本文研究的最大难点。施一公研究组分别进行了体内内源直接阻断和体外建立剪接反应阻?#31995;确?#27861;的尝试,最终都无法获得稳定的B* complex样品。在最新发表的这篇《细胞》文章中,施一公研究组将体内阻断与体外建立剪接反应相结合,对提纯方案多次探索,最终优化出一套可以获得稳定的、性质良好的B* complex样品。为了探索剪接体对不同pre-mRNA底物的识别特异性,施一公研究组选取了领域内常用的两种pre-mRNA作为剪接体结?#31995;?#24213;物,随后利用单颗粒冷冻电镜技术重构出了4个不同构象B* complex整体分辨率为2.9埃-3.8埃的冷冻电镜结构,并搭建了原子模型,其中包含了4条RNA和35个蛋白(图2)。

   

  图2 酿酒酵母催化激活剪接体4个构象的三维结构

  该文解析的4个不同构象的B* complex结构,?#29366;?#23637;示了RNA剪接第一步反应发生过程中分支点如何被剪接体逐步“推入”活性反应中心的动态变化,其中第一步剪接因子Yju2在稳定分支点中发挥了举足轻重的作用,尽管此时5’剪接位点与分支点的距离十分接近(4.3埃),却不足以形成磷酸二脂键。从而,该结构也清晰地揭示了关键蛋白因子Cwc25在激发第一步剪接反应中的重要作用(图3)。值得一提的是,在这个结构中,第一次观察到了pre-mRNA中分支点A被5’剪接位点GU通过经典的碱基互补配对以及碱基堆积力共同识别的机制,这个结构信息进一步证明了该位点在真核生物中高度保守的重要性。本文另一大亮点是?#29366;?#25581;示了剪接体对不同pre-mRNA底物识别的特异性,为体内不同pre-mRNA的剪接效率存在差异提供了最直接的结构信息。

   

  图3 酿酒酵母剪接体介导分支反应的模型

  截至目前为止,施一公研究组在酵母中一?#27493;?#26512;了10个不同状态的剪接体高分辨的三维结构(如图4),成果全部发表于国?#35782;?#32423;期刊《科学》和《细胞》(Science 7篇,Cell 3篇),从组装到被激活,从发生两步转酯反应发生到剪接体的解聚,这10个状态的剪接体完整覆盖了剪接通路,?#29366;?#23558;剪接体介导的RNA剪接过程完整的串联起来,为理解RNA剪接的分子机理提供了最清晰、最全面的结构信息。(观看完整视频请点文末链接)

   

  图4 施一公研究组解析的酵母剪接体结构汇总

  (?#35745;?#26469;源: https://ygshi.org/research

  清华大学生命学院施一公教授为本文的通讯作者;清华大学医学院博士后、高精尖创新中心卓越学者万蕊雪、生命学院四年级博士研究生白蕊为该文的共同第一作者,清华大学生命学院博士后、高精尖创新中心卓越学者?#25340;?#19994;为结构模型的搭建提供了帮助;清华大学冷冻电镜?#25945;?#20027;管雷建林博士为冷冻电镜数据收集提供了帮助。电镜数据采集于清华大学冷冻电镜?#25945;ǎ?#35745;算工作得到清华大学高性能计?#38379;教ā?#22269;家蛋?#23383;?#35774;施实验技术中心(?#26412;?#30340;支持。本工作获得了?#26412;?#32467;构生物学高精尖创新中心(清华)及国家自然科学基金委的经费支持。

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